Haben Sie sich schon mal die Frage gestellt, ob die durchgeführte Kalibrierung wirklich die geforderte Wiederholbarkeit der Methode erreicht? Kennen Sie wirklich die Präzision der durchgeführten Analysenmethode? Haben Sie vielleicht ein eigenes kalibrierbedürftiges Analysenverfahren entwickelt und wollen mehr über die Leistungsfähigkeit erfahren? Bei der Beantwortung aller dieser Fragen hilft die Bestimmung von Verfahrenskenndaten, denn bevor ein neues Analysenverfahren in der Routineanalytik verwendet werden kann, müssen die einzelnen Verfahrensschritte festgelegt, optimiert und deren Leistungsfähigkeit überprüft werden. Für kalibrierbedürftige Analysenverfahren werden zu Beginn die Verfahrenskenndaten ermittelt und im Anschluss gemeinsam mit der Analysenvorschrift dokumentiert, welche dann die Grundlage für eine spätere Qualitätssicherung in der Routineanalytik bilden.
Für die Ermittlung von Verfahrenskenndaten gibt es unterschiedliche Möglichkeiten, entweder man erwirbt eine kostenpflichtige Software oder man schreibt statistische Routinen zur Berechnung selbst. Im Folgenden wird mit Hilfe von Microsoft Excel eine Berechnung gemäß DIN 32645 durchgeführt und durch die notwendigen Schritte zur Ermittlung der Verfahrenskenndaten hindurchgeleitet.
Die notwendigen statistischen Methoden finden in erster Linie ihre Anwendung während der Erstellung eines neuen Analysenverfahrens. Darüber hinaus sind sie geeignet, dem Analytiker während der Erprobung und Einübung eines kalibrierbedürftigen Analysenverfahrens Informationen über die aktuell erreichte Analysenqualität zu geben. Die Verfahrenskenndaten sollten auch bei jeder Neukalibrierung des Analysenverfahrens ermittelt werden, so z.B. nach
- Reagenzienwechsel
- technischen Eingriffen in Analysengeräten
- u.a.
Grundlegender Aufbau der Vorlage und notwendige Einstellungen
Die Vorlage ist optisch in unterschiedliche Bereiche aufgeteilt. Im Kopf des Dokuments befinden sich die für Qualitätsmanagementsysteme typischen Lenkungsdaten und die Überschrift des Dokuments. Diese müssen vor einer Verwendung im Labor an Ihre Bedürfnisse angepasst werden. Es werden auf der linken Seite Felder für eine Identifikationsnummer (ID) des Dokuments, die aktuelle Version und das Erstellungsdatum angeboten. Rechts befinden sich Felder für den Autor, denjenigen der die Freigabe erteilt und einen Hinweis auf etwaige Register (Anzahl der Arbeitsblätter, hier eins).
Darunter befindet sich ein Feld zur Erfassung der verwendeten Standards, dort werden die Chemikalien mit den Informationen des Herstellers hinterlegt, z.B. die Charge, Haltbarkeitsdatum und Hersteller. Direkt rechts daneben befinden sich die Auswahl der Spracheinstellung. Über das Menu kann die Sprache Deutsch und Englisch ausgewählt werden, welche dann alle im Formular angezeigten Felder übersetzt. Darunter wird die das Kürzel der Methode eingetragen, das kann die z.B. die DIN-Nummer sein oder eine interne Identifikationsnummer. Zur Nachverfolgung des verwendeten Geräts wird der Typ im Feld Gerät eingetragen (z.B. ICP-OES, EDX, u.a.) und darunter die Prüfmittelnummer. Im Feld „Einheit, Messwert“ wird die vom Gerät ermittelte Einheit eingetragen, so z.B. die Flächeneinheit des Peaks oder die Counts an einem Detektor. Die Einheit der Referenz ist die Konzentration des Standards z.B. in mg/L. Darunter befinden sich Auswahlfelder für die Nachkommastellen zur Darstellung im Formular. Der beschriebene Bereich dient folglich zur Lenkung, Formatierung des Formulars und zur Nachverfolgung verwendeter Chemikalien und Geräte.
Kalibrierung des analytischen Grundverfahrens
Bei einem kalibrierungsbedürftigen Analysenverfahren führt die Anwendung des physikalischen Messprinzips nicht direkt zum Analysenergebnis, der enthaltene Messwert stellt lediglich ein physikalisches Messergebnis dar, das über die zuvor empirisch gewonnenen Verfahrenskenndaten in das Analysenergebnis umgerechnet werden muss. In unserem Beispiel der Röntgenfluoreszens (EDX) werden am Detektor z.B. die Counts über die Zeit gemessen. Die Konzentration einer Probe ergibt sich dann aus der Funktion von den Counts, dem eigentlichen Messwert und der Konzentration der Referenzprobe. Zur Berechnung der Verfahrenskenndaten kann während der Kalibration der Messwert einfach oder mehrfach bestimmt werden. Bei einer Mehrfachbestimmung wird der Mittelwert zwischen den Werten gebildet. Die Häufigkeit der Einzelmessungen beeinflusst die Berechnung der Verfahrenskenndaten, entsprechen ist es wichtig hier den genauen Wert einzutragen!
Im Bereich Parameter wird in der ersten Zeile die Anzahl der Einzelbestimmungen eingetragen. In unserem Beispiel werden drei Messwerte für einen Kalibrierpunkt ermittelt. Das Signifikanzniveau, gibt an, wie hoch das Risiko ist, das man bereit ist einzugehen, eine falsche Entscheidung zu treffen. Für die meisten Tests wird ein Wert von 0,95 bzw. 0,99 verwendet. Ein Wert von 0,95 bedeutet, dass man bei fünf von hundert Messwerten einen Fehler 1. Art toleriert. Der Fehler 2.Art berücksichtigt den Fall, wenn der Fehler 1. Art nicht berücksichtigt wird. Ein Wert von 0,95 ist für die meisten Experimente die geeignete Größe, um ein ausgewogenes Verhältnis zwischen dem Fehler 1. und 2. Art sicherzustellen. Rechts im Bild oben anbei befindet sich ebenfalls der Bereich Verfahrenskenndaten der die berechneten Werte aufführt. Auf den Bereich wird im Folgenden genauer eingegangen.
Festlegung des Arbeitsbereichs
Jede Kalibrierung beginnt mit der Wahl eines vorläufigen Arbeitsbereichs. Dieser richtet sich nach dem praxisbezogenen Anwendungsziel und sollte einen größeren Anwendungsbereich als die Routineproben abdecken. Dabei liegt üblicherweise die Arbeitsbereichsmitte bei der häufigsten Probenkonzentration. Ebenfalls sind die technischen Möglichkeiten des Geräts zu berücksichtigen. Eine Überschreitung ist zumeist daran zu erkennen, dass die Kalibration nicht mehr linear verläuft, sondern davon abweicht. Die Messwerte an der untersten Arbeitsbereichsgrenze müssen sich signifikant von dem Verfahrensblindwert unterscheiden. Die Analysenpräzision muss im gesamten Arbeitsbereich erreichbar sein. Bei Varianzinhomogenität oder Unlinearität ist der gewählte Arbeitsbereich so weit zu verkleinern, bis diese Bedingungen erfüllt sind. Aufwendigere Kalibriermodelle, wie Regressionsfunktionen höheren Grades, sind grundsätzlich denkbar sollen aber im folgenden Beispiel nicht berücksichtig werden.
Vorbereitung der Standardproben
Für viele Aufgaben gibt es bereits vorgefertigte Standards kommerziell zu kaufen, sollten Standards selber gefertigt werden sind folgende Anforderungen zu berücksichtigen:
- Reinheit
- Matrixfreiheit oder definierte Matrix
- Homogenität
- Repräsentativität in Bezug auf die realen Proben (chemisch ähnliche Verbindung, gleiche Oxidationsstufe, etc.)
- Haltbarkeit
- Aufbewahrung in Gefäßen ohne Probenbeeinflussung
Bei der Herstellung der Standardproben muss die Präzision der Waagen und Volumenmessgeräten berücksichtigt werden. Die Wägung ist der Volumetrie, auf Grund der Präzision, vorzuziehen. Auf sukzessive Verdünnungen ist, wegen der Fehlerfortpflanzung, zu verzichten. Nach Festlegung des vorläufigen Arbeitsbereichs werden mindestens sechs äquidistante Konzentrationen der Standardproben über den gesamten Arbeitsbereich erstellt.
Ermittlung der Kalibrierfunktion
Aus den für diese Standardproben ermittelten Messwerten werden die vorläufigen Kalibrierfunktionen berechnet, deren Verfahrenskenndaten für weitere statistische Tests benötigt werden. Die Mess- und Referenzwerte werden dabei in die Tabelle wie unten anbei eingetragen.
Ausreißer werden innerhalb der Tabelle mit Pfeilen gekennzeichnet. Eine Beurteilung sollte jedoch erst ab sechs Wertepaaren erfolgen. Die Regressionsanalyse liefert die Kalibrierfunktion, welche in der Abbildung unten als schwarzer Strich dargestellt ist. Die blauen Punkte sind die Wertepaare aus der Tabelle. Auch hier werden Ausreißer durch rote Kreise hervorgehoben.
An dieser Stelle erfolgt auch direkt die erste Überprüfung der Güte der durchgeführten Kalibrierung. Im einfachsten Fall wird die Kalibriergerade durch eine subjektive Beurteilung auf Linearität hin überprüft. Ergibt sich eine offensichtliche Unlinearität mit hoher Präzision der Messwerte ist u.a. der Kalibrierbereich zu hinterfragen, denn zu große Konzentrationsbereiche führen oft zu einem nicht linearen Verhalten am Detektor. Bei schlechter Präzision, also einer ausgeprägten Streuung der Messpunkte ist die Konzentration unter Umständen zu niedrig für eine Detektion. Auch hier hilft eine Verschiebung oder Anpassung des Konzentrationsbereichs.
Weiterhin werden die Residuen untersucht, welche der Ordinatenabstand der Punkte zur Kalibrierfunktion sind. Im Bild oben anbei ist eine exemplarische Darstellung einer Residualanalyse aufgeführt. Um die Abszisse herum liegen die Wertepaare, welche sich aus dem Index des Kalibrierpunkts und den ermittelten Residuen ergeben. Bei der Analyse werden vier unterschiedliche Fälle betrachtet:
In (a) ist eine Linearverteilung dargestellt, hier liegen gleichviele Punkte oberhalb wie unterhalb der Linie und haben eine zufällige Verteilung. Bei dieser Verteilung ist alles OK. In (b) zeigt sich ein Trend, indem die Punkte von links nach rechts hin ansteigen. Oft ist das ein Indiz für einen falschen Ansatz der Proben oder einen Rechenfehler. Ebenfalls können die Punkte V-Förmig auseinanderdriften wie in (c) dargestellt. Dabei handelt sich zumeist um eine systematische Varianzinhomogenität, bei der die oberen Konzentrationen der Kalibrierung ungenauer sind. Ebenfalls können die Residuen sich stark unterscheiden, auch das ist ein Indiz für eine Kalibration mit Varianzinhomogenität. In (d) ist ein Fall für eine nicht lineare Regression 1. Grades dargestellt. Üblich ist hierbei eine Wahl eines anderen Konzentrationsbereichs oder einer Aufteilung dessen.
Ausreißertest
Kalibrierdaten müssen grundsätzlich ausreißerfrei sein. Verdächtige Werte können mittels verschiedener Tests überprüft werden. Der einfachste Test ist sich die Residuen anzuschauen und Punkte die, besonders ausgeprägt nach oben oder unten, Abweichen zu verwerfen. Andere Methoden sind z.B. der F-Test, t-Test, Grubbs-Test und auch andere Verfahren auf die, an dieser Stelle der Einfachheit halber, nicht weiter eingegangen werden soll. Im Arbeitsblatt wurde der Test nach Grubbs für Ausreißer angewendet.
Ermittlung der Verfahrenskenndaten
Die Verfahrenskenndaten werden im Hintergrund automatisch berechnet und sind im Bild unten anbei auf der rechten Seite im Arbeitsblatt zu finden.
Bei Messwerten oberhalb der Nachweisgrenze und unterhalb der Erfassungsgrenze können Entscheide für enthalten oder nicht enthalten getroffen werden kann. Oberhalb der Erfassungsgrenze und unterhalb der Bestimmungsgrenze sind halbquantitative Aussagen möglich. Oberhalb der Bestimmungsgrenze kann der Gehalt mit dem Vermerk des Vertrauensbereichs quantitativ angegeben werden. Der Vertrauensbereich ist dabei ein Maß für die Genauigkeit des Messverfahrens und gibt die Schwankungsbreite eines Ergebnisses an. Die Korrelation ist ein Maß für die Güte der Kalibrierfunktion und sollte möglichst nahe bei 100% liegen. Die Empfindlichkeit gibt an wie empfindlich das Analysenverfahren auf Konzentrationsveränderungen reagiert, allgemein gilt je höher der Wert desto besser das Verfahren.
Überprüfung auf Matrixeffekte
Ein wesentliches Gütekriterium eines Analysenverfahrens ist dessen Anwendbarkeit auf natürliche Proben. Aus diesem Grund ist das Verfahren auf die Beeinflussung durch zusätzliche Verfahrensschritte wie Aufschlüsse, Extraktionen oder Interferenzen und Matrixeffekte hin zu untersuchen. Verfahrensschritte und Matrixeffekte können sich in einer Erhöhung der Unpräzision, als konstant- oder proportional-systematische Abweichung der Analysenergebnisse von den wahren Werten äußern. Zur Überprüfung einzelner Verfahrensschritte eignet sich die Wiederfindungsfunktion, um Abweichungen aufzudecken. Die Berücksichtigung einer Kalibrierung mit Matrix erfolgt, wie im Bild oben anbei links gezeigt, durch Einschalten der Funktion Standardaddition.
Ermittlung und Bewertung der Wiederfindungsfunktion
Ziel der Wiederfindungsexperimente und der Aufstellung der Wiederfindungsfunktion ist die Ermittlung des Einflusses einer Verfahrens- oder Probenmodifikation auf das Analysenverfahren. Die Untersuchungen erfolgen über den gesamten Standardarbeitsbereich.
Wie im Bild oben anbei dargestellt werden zu dem Zweck die berechneten Konzentrationen aus der Kalibrierfunktion in das Feld Referenzwert kopiert und anschließend die Werte der Wiederfindungsexperimente unter Messwert eingetragen. Im Wiederfindungsexperiment werden dazu die Standards mit der entsprechenden Matrix und angepassten Verfahrensschritten hergestellt. Im optimalen Fall verläuft die neue Funktion durch den Ursprung und hat eine Steigung von eins. Für gewöhnlich ist der Vertrauensbereich ebenfalls größer als die ursprüngliche Kalibrierfunktion.
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